免疫組化輔助試劑包(SP法)

使用說明書

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第1版(2016年04月修訂)

[產品信息]

通過生物素標記的二抗(抗抗體)與結合在組織切片上的一抗特異性結合形成免疫復合物,為進一步提高信號的強度,借助生物素和鏈霉親和素信號放大系統,生物素會和辣根過氧化物酶(HRP)標記的鏈霉親和素結合,形成更為復雜的聚合物。位于聚合物上HRP會催化底物H2O2與DAB反應,最終形成棕褐色不溶性色原,特異性的將免疫原在組織和細胞中標定出來,通過顯微鏡觀察確定免疫原的最終位點。

[試劑組分]

編號

成分

                      包裝規格

1

內源性過氧化物酶阻斷劑工作液

3mL

6mL

18mL

55mL

110mL

2

生物素標記抗IgG聚合物(可?。?/p>

3mL6mL18mL55mL110mL

3

HRP標記的鏈霉親和素工作液

3mL6mL18mL55mL110mL

4

封閉血清工作液

3mL6mL18mL55mL110mL

5

蘇木素染液

3mL6mL18mL55mL110mL

6

枸櫞酸鈉抗原修復液

10mL

20mL

60mL

200mL

400mL

7

顯色劑 (1×)

3mL

6mL

18mL

55mL

110mL

8

DAB顯色液 (50×)

60uL

120uL

360uL

1.1mL

2.2mL

[備選指標]

編號

名稱

編號

名稱

IS085-1

生物素標記兔抗人IgG聚合物

IS085-9

生物素標記兔抗犬IgG聚合物

IS085-2

生物素標記兔抗小鼠IgG聚合物

IS085-10

生物素標記兔抗綿羊IgG聚合物

IS085-3

生物素標記兔抗大鼠IgG聚合物

IS085-11

生物素標記兔抗貓IgG聚合物

IS085-4

生物素標記兔抗豬IgG聚合物

IS085-12

生物素標記兔抗馬IgG聚合物

IS085-5

生物素標記兔抗雞IgG聚合物

IS085-13

生物素標記山羊抗兔IgG聚合物

IS085-6

生物素標記兔抗牛IgG聚合物

IS085-14

生物素標記山羊抗小鼠IgG聚合物

IS085-7

生物素標記兔抗山羊IgG聚合物

IS085-15

生物素標記豚鼠抗兔IgG聚合物

IS085-8

生物素標記兔抗豚鼠IgG聚合物



[適用范圍]

本產品僅用于免疫組化實驗,適用于手工和機器大批量操作。本試劑僅對10%中性緩沖福爾馬林固定石蠟包埋的組織進行了驗證,不作其他用途。

[儲存及有效期]

2~8℃避光保存,不得凍存;產品有效期為6個月。

[實驗操作]

1、完成IHC實驗還要的設備和試劑

   a)、移液器、恒溫箱、修復儀、免疫組化筆、計時器、孵育盒、染色架、蓋玻片、光學顯微鏡、洗瓶。

   b)、DAB顯色液:利用顯色劑稀釋DAB顯色液到工作液濃度,現配現用。

   c)、pH 6.0,0.01M枸櫞酸鈉抗原修復液:利用雙蒸水稀釋到工作液濃度使用。

1、實驗步驟

(1)烘片:鉛筆標記用于區分石蠟切片,65℃,1-2h。

(2)脫蠟至水:烘片結束,石蠟切片依次于二甲苯I 30min,二甲苯II 30min,100%、100%、95%、80%、70%的乙醇中各10min,再放入純水里10min。

(3)抗原修復。高溫高壓法和微波法自選。

      高溫高壓法:壓力鍋中加入pH 6.0 ,0.01M枸櫞酸鈉抗原修復液約1000ml,切片插入塑料架上,放入壓力鍋,蓋上鍋蓋(此時不扣上壓力閥)1600W預熱至沸騰,扣上壓力閥1300W,待高壓鍋閥門噴氣開始計時,修復時間為2分鐘。

      微波法:取一定量pH 6.0 ,0.01M枸櫞酸鈉抗原修復液,加入微波盒中,微波加熱至沸騰,將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上,放入已沸騰的緩沖液中,微波低火處理3分鐘,放置8分鐘后低火3分鐘,取出微波盒流水自然泠卻,從緩沖液中取出玻片,先用蒸餾水沖洗兩次,之后用PBS沖洗3分鐘×3次。

(4)阻斷內源性過氧化物酶。加入適量的內源性過氧化物酶阻斷劑,室溫孵育10分鐘;PBS緩沖液沖洗3分鐘×3次。

(5)非特異性位點的封閉:甩去殘夜,滴加封閉血清工作液覆蓋切片,約200ul/片,室溫孵育20min。

(6)滴加一抗。根據組織大小,滴加適量的一抗,37℃孵育60分鐘;PBS緩沖液沖洗3分鐘×3次。

(7)根據實驗物種的差異選擇合適的生物素標記抗IgG聚合物,滴加100μL或適量的生物素標記抗IgG聚合物,37℃孵育30分鐘;PBS緩沖液沖洗3分鐘×3次。

(8)滴加辣根酶標記鏈霉親和素工作液。滴加100uL或適量的辣根酶標記鏈霉親和素工作液,37℃孵育30分鐘;PBS緩沖液沖洗3分鐘×3次。

(9)顯色。加入適量新鮮配制的DAB,室溫孵育5秒-5分鐘,根據顯微鏡下著色情況終止反應。

(10)復染。自來水沖洗,蘇木素染色液孵育2分鐘;滴加1%鹽酸酒精分色1秒、PBS沖洗返藍。

(11)脫水、透明、封片

(12)顯微鏡觀察,拍照。

[注意事項]

1、在每一次染色過程中,必須有空白對照和陰性對照實驗同時進行。

2、如果陽性組織對照不能顯示適當的陽性染色,應判定該批次樣本的檢測結果無效。

3、若生物素標記IgG聚合物孵育溫度過高或孵育時間過長,可能導致染色過強及背景染色。

4、紅細胞和細胞色素 C可能會造成假陽性結果。

5、脫蠟不徹底,容易影響染色效果,建議免疫組化切片脫蠟與常規HE脫蠟分開。

6、為防止可能出現的假陽性、假陰性結果,在實驗過程中需設置陽性與陰性對照。

7、實驗中滴加試劑時,過多的PBS緩沖液會導致試劑被稀釋,將引起染色強度變弱,因此,滴加試劑前應除去多余的緩沖液。

8、在實驗操作過程中,請穿戴好手套、眼鏡和實驗服,以及依照相應的實驗流程,做好防護措施。


  • IHC Support Pack (SP Method)
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